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              大鼠骨髓來源的內皮祖細胞體外培養方法

              更新時間:2024-03-28      點擊次數:68

              1. SD大鼠,250g,通過頸椎脫位處死大鼠,浸入75%乙醇浸泡5分鐘,轉移到通風柜中的解剖盤中。

              2. 打開皮膚,暴露、收集股骨,無菌狀態下移除附著的肌肉和組織。

              3. 并轉移股骨至預冷含雙抗的PBS中,洗滌三次。冰上操作。

              4. 切斷股骨骨骺, 使用5mlPBS,1ml注射器針頭沖洗,沖洗液由棕色變成粉紅色即可(股骨變白)。沖洗后,用1ml注射器吹打3-5次。

              5. 70um濾網過濾,棄去篩網。使用 15ml 離心管,先加入分離液,然后緩慢加入濾過的懸液。20℃環境下,600g 離心 25min。

              6. 離心后,離心管中液體由上至下分為四層。第一層為稀釋液層。第二層為環狀乳白色單個核細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。

              7. 小心吸取離心管中的,環狀乳白色單個核細胞層,轉移到新離心管中,加入 5-10ml 洗滌液,混勻細胞。400g,離心 10min。

              8. 棄去上清,用吸管吸取 5ml 清洗液重懸所得細胞。 250g,離心 10min,棄去上清。 再用M199完丨全培養基(10 ng/mL VEGF,1 ng/mL b-FGF,1 ng/mL EGF,20%胎牛血清、1%雙抗清洗一次,棄去上清,M199完丨全培養基重懸細胞。250g,離心 10min,棄去上清。M199完丨全培養基重懸細胞,計數。

              9. 3×106/孔種入纖連蛋白包被過的24孔板,每3天換一次培養基,以去除非貼壁細胞,持續誘導培養2-3周。


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